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针对上述问题，中国科研院生物物理研究所范克龙、郑州大学第一附属医院肝胆胰外科党晓卫和Ying Cui团队构建了“AND”逻辑门控纳米反应器NR@Cur@Gox，将姜黄素（Cur）与Gox共载于一体。该纳米系统在生理pH的正常组织中保持疏水关闭状态；到达酸性肿瘤细胞后，PC6A质子化增强膜通透性，葡萄糖进入核心被Gox分解为H₂O₂和葡萄糖酸；局部高浓度H₂O₂触发纳米载体自毁，释放Cur和醌甲基化物。Cur抑制GLUT1表达，阻断葡萄糖摄取和乳酸化，并协同醌甲基化物耗竭谷胱甘肽（GSH）。顺利获得葡萄糖剥夺、H₂O₂累积与GSH耗竭，激活AMPK-SREBP1-SCD1-LPO和ROS-GPX4双轴，协同诱导铁死亡。饥饿与铁死亡联合引发强免疫原性细胞死亡，促进CD8⁺ T细胞增殖，降低Treg和M2-TAM，逆转免疫抑制微环境为“热”肿瘤，显著抑制胰腺癌移植瘤生长，并在与抗PD-L1联合应用时进一步增强免疫治疗效果，实现了“最大疗效-最小副作用”的代谢干预策略。相关研究在2025年6月26日以“An ‘AND’ Logic Gate Nanoreactor for Metabolic Remodeling in Starvation-Ferroptosis-Immunotherapy of Pancreatic Cancer”为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202502221）。

图1 一种“AND”逻辑门控纳米反应器（NRs@Cur@Gox）的自组装及其“AND”逻辑药物释放、顺序pH激活与ROS自焚降解机制，顺利获得代谢重塑在肿瘤部位协同饥饿-铁死亡-免疫疗法

（1）pH-ROS双响应纳米反应器的制备与表征

DLS与TEM（图2A）显示NRs为均匀囊泡，仅在pH 5.5+1 mM H₂O₂出现双峰并粒径增大；ζ电位（图2B）在此条件下由−10 mV升至+18.2 mV；GSH探针（图2C）仅在pH 5.5+H₂O₂组GSH显著降低，证实QM释放。载药NRs@Cur@Gox释药实验（图2D–F）表明，Cur与Gox在pH 7.4或单一刺激下释放<40%，而在pH 5.5+H₂O₂或+葡萄糖条件下分别约90%与85%，实现“AND”逻辑门控精准释药。

图2 NRs@Cur@Gox表征。（A）不同溶液中NRs尺寸分布（插图TEM）；（B）zeta电位；（C）QM消耗；（D）释放机制；（E-F）不同溶液中Cur与Gox释放曲线；（G）NRs@Cur/NRs@FITCGox细胞内摄取CLSM；（H）FCM分析

（2）双药纳米反应器重塑PC糖酵解-乳酸轴

细胞摄取实验（图2F–G）显示，游离FITC-Gox几乎无绿色荧光，而NRs@FITC-Gox在2 h和4 h的摄取率分别达75.0%与82.1%；同样，NRs@Cur的摄取效率在2 h为82.6%，显著高于游离Cur的62.5%，4 h时分别为91.2%与72.4%，提示纳米载体显著提升细胞内递送效率。机制研究（图3A–C）表明，GLUT1–乳酸–MCT4轴的抑制可下调AMPK–SREBP1–SCD1信号，减少多不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化，从而阻断铁死亡。代谢分析（图3D–E）进一步证实，NRs@Cur处理使胞外葡萄糖水平升高并降低胞内葡萄糖与乳酸，NRs@Gox则同时降低胞内外葡萄糖并促进乳酸外排，而两者联合（NRs@Cur@Gox）可进一步降低葡萄糖及乳酸水平。胞内酸度检测（图3F–H）显示，随着乳酸减少，胞内酸化程度下降，其中NRs@Cur@Gox组荧光信号最低，表明其在调节糖乳酸代谢及改善胞内酸化方面具有最显著效果。

图3 NRs@Cur@Gox诱导饥饿与铁死亡的机制示意图。（A）葡萄糖转运驱动的饥饿抗性与免疫抑制微环境；（B）NRs@Cur重塑饥饿抗性；（C）NRs@Cur@Gox协同促进饥饿-铁死亡并逆转免疫抑制；（D–F）细胞外与胞内葡萄糖、乳酸及pH值变化；（G–H）胞内pH的CLSM与流式定量；（I–J）胞内LPO的CLSM与流式定量；（K）饥饿-铁死亡轴蛋白Western印迹；（L）MCT4、GLUT1、GPX4免疫荧光；（M）线粒体bioTEM

（3）铁死亡

活性氧荧光探针检测（图3I）显示，NRs@Gox、NRs@Cur及NRs@Cur@Gox处理均可诱导细胞产生明显绿色荧光，其中NRs@Cur@Gox组脂质过氧化（LPO）水平较对照升高约3.6倍（图3J）。进一步的分子机制分析（图3K–L）表明，NRs@Cur@Gox显著激活AMPK信号并上调SREBP1–SCD1通路，同时抑制GPX4表达、升高ACSL4水平；免疫荧光结果亦显示MCT4和GLUT1下调、GPX4显著降低。超微结构观察（图3M）可见线粒体体积缩小、嵴结构消失及外膜破裂；JC-1染色结果提示该组红色荧光最弱、绿色荧光最强，表明线粒体膜电位显著下降。

（4）体外抗肿瘤

血液相容性检测（图4A）显示，NRs在200 µg mL⁻¹浓度下未引起溶血反应。细胞活力测定（图4B）表明，PBS组在24 h和48 h的存活率接近100%，NRs@Cur组分别为61%和52%，NRs@Gox组为88%和95%，而NRs@Cur@Gox组最低，仅为50%和35%，其联合指数接近1，提示Cur与Gox协同致死效应有限。细胞增殖与死亡染色（图4C）结果显示，Calcein-AM/PI及结晶紫检测的增殖能力顺序为PBS > NRs@Gox > NRs@Cur > NRs@Cur@Gox，其中NRs@Cur@Gox组细胞死亡率超过50%。凋亡分析（图4D）进一步验证了该趋势，Annexin V-FITC/PI流式检测显示NRs@Cur@Gox组细胞存活率仅为19.1%。广谱MTT检测结果表明，NRs@Cur@Gox对所有受试肿瘤细胞系均表现出显著的杀伤活性。

图4 NRs@Cur@Gox体外抗癌功效。（A）不同浓度NRs溶血分析；（B）Pan02细胞经不同NRs处理24 h与48 h后的活力；（C）结晶紫及Calcein-AM/PI染色示活（绿）死（红）细胞；（D）不同NRs诱导的凋亡流式分析，活细胞列于矩形框内；（E-F）CRT与HMGB1免疫荧光染色；（G-H）CRT流式定量与HMGB1 ELISA检测；（I）上清液ATP含量

（5）体外ICD效应、DC成熟和TAM极化

免疫原性细胞死亡（ICD）相关标志物检测（图4E–I）显示，NRs@Cur@Gox处理可诱导最强的CRT膜暴露红色荧光及最显著的HMGB1核-质易位与胞外释放；量化结果表明，其CRT绿色荧光强度高于NRs@Cur与NRs@Gox，且显著高于PBS组，培养上清中HMGB1含量亦最高。同时，NRs@Cur@Gox处理后ATP分泌量约为PBS组的2.1倍。免疫激活分析（图5A–B）显示，NRs@Cur@Gox可将CD80⁺CD86⁺MHC II⁺树突状细胞比例提升至最高水平。巨噬细胞极化实验（图5C–D）进一步表明，NRs@Cur@Gox组上清可使M1型（F4/80⁺CD86⁺）比例升至45.8±5.2%，而M2型（F4/80⁺CD206⁺）比例下降至3.05±1.5%。炎症因子检测（图5E–F）结果显示，NRs@Cur@Gox组IL-12α、TNF-α、iNOS及IL-6表达水平最高，IL-10最低，提示其在促进抗肿瘤免疫应答方面具有显著优势。

图5 NRs@Cur@Gox体外免疫应答。（A）流式细胞术检测树突状细胞成熟；（B）对应荧光强度定量；（C）流式细胞术检测TAM极化；（D）对应荧光强度定量；（E）CD80与CD206免疫荧光图像；（F）RT-PCR定量M1-及M2-TAM相关炎症因子

（6）体内分布验证与ICD-免疫微环境重塑

体内分布成像（图6A–C）显示，NRs@DiD经静脉注射后在8 h时肿瘤部位荧光达到峰值，其强度约为游离DiD的1.92倍；即使在给药24 h后，离体肿瘤组织荧光仍高出1.71倍，提示其具备优异的肿瘤富集与滞留能力。免疫荧光结果进一步表明，NRs@Cur@Gox组肿瘤组织中GLUT1和MCT4表达最低，GPX4显著抑制，同时CRT膜暴露最强，HMGB1外排量最高。免疫激活分析（图6F）显示，肿瘤引流淋巴结中CD80⁺CD86⁺CD11c⁺成熟树突状细胞比例在NRs@Cur@Gox组达12.0±1.0%，为各组最高。免疫微环境重塑分析（图6G）进一步发现，NRs@Cur@Gox组CD8⁺T细胞浸润量较PBS组升高2.42倍，分别为NRs@Cur和NRs@Gox组的1.41倍和1.28倍；F4/80⁺CD206⁺ M2型肿瘤相关巨噬细胞占比则降至PBS组的0.35倍、NRs@Cur组的0.51倍及NRs@Gox组的0.36倍，表明其在抑制免疫抑制性细胞、增强细胞毒性T细胞浸润方面具有显著优势。

图6 NRs体内生物分布与免疫应答。（A）静脉注射NRs@DiD或游离DiD（2.5 mg DiD kg⁻¹）后不同时间Pan02荷瘤小鼠活体荧光成像；（B）对应肿瘤平均荧光强度；（C）24 h离体肿瘤及主要器官荧光成像；（D）24 h离体组织平均荧光强度；（E）实验流程及治疗计划示意图；（F）流式分析dLN CD80⁺CD86⁺细胞及脾CD4⁺、CD8⁺、F4/80⁺CD206⁺细胞；（G）对应流式定量

（7）体内抗肿瘤

体内抗肿瘤疗效评估（图7A–E）显示，小鼠分别于第1、4、7天静脉注射PBS、NRs@Cur、NRs@Gox或NRs@Cur@Gox（Cur剂量5 mg kg⁻¹）。在21 d观察期内，NRs@Cur与NRs@Gox单药组肿瘤体积均增长至约1000 mm³，而NRs@Cur@Gox组肿瘤生长完全停滞并出现轻度回缩，其终末肿瘤重量亦为最低（图7D）。组织学分析（图7F–G）表明，NRs@Cur@Gox组肿瘤组织TUNEL阳性细胞比例最高，H&E染色亦呈现最显著的凋亡与组织破坏。安全性评估（图7H–I）显示，各组小鼠体重曲线均平稳，主要脏器H&E形态学及血生化指标在NRs@Cur@Gox组与PBS对照间无显著差异，提示该联合体系具备优良的体内安全性。

图7 NRs@Cur@Gox体内抗肿瘤作用。（A）肿瘤诱导及治疗流程示意图；（B-C）21 d内Pan02肿瘤体积变化；（D）第21 d肿瘤重量；（E）第21 d离体肿瘤照片；（F）第21 d肿瘤TUNEL凋亡染色；（G）第21 d肿瘤及主要器官H&E染色；（H）21 d体重曲线；（I）21 d血清生化指标

（8）NRs@Cur@Gox 协同 aPD-L1 打破免疫抑制

协同免疫治疗效果评估（图8A–E）显示，在Pan02荷瘤小鼠模型中，NRs@Cur@Gox联合aPD-L1治疗可显著抑制肿瘤进展。PBS组小鼠肿瘤体积在第13天即增至约800 mm³，而联合治疗组肿瘤重量仅约0.25 g，且体重无显著变化。免疫微环境分析（图8F–I）进一步表明，联合治疗组在肿瘤及脾脏中均表现出最高比例的细胞毒性T淋巴细胞（CTL, CD3⁺CD8⁺）和辅助性T细胞（CD3⁺CD4⁺），同时Treg及M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）比例最低，提示该策略可有效增强抗肿瘤免疫应答并缓解免疫抑制微环境。

图8 NRs@Cur@Gox联合aPD-L1体内协同抑瘤。（A）肿瘤诱导及治疗流程示意图；（B-C）13 d内Pan02肿瘤体积变化；（D）第13 d离体肿瘤照片；（E）第13 d肿瘤重量；（F-G）肿瘤与脾脏免疫细胞流式分析；（H-I）对应免疫细胞定量